客户成功案例

高意 Axon 光纤激光器的双光子代谢荧光寿命成像

Becker & Hickl GmbH——光子计数设备领域的技术领导者——此前已证明，小型飞秒光纤激光器 作为多光子荧光成像系统的经济型激发光源。激光器 具有780 nm的发射波长、40 MHz至80 MHz的脉冲频率以及100 mW至500 mW的平均功率激光器 不仅激光器 NAD(P)H的激发，还激光器 多种其他荧光染料[1, 2]，包括那些荧光寿命极短的染料[3, 4, 5]。

因此，贝克尔和希克尔很想知道…… Axon 飞秒光纤激光器在这些应用中的表现如何。

图1

图1：高意 Axon 飞秒激光器

 

系统架构

作为测试系统，他们使用了bh DCS-120 MP多光子荧光寿命成像系统。该系统的架构如图2所示。 

图2
图2：多光子激光扫描 FLIM系统的原理
Axon 激光束 自由光束注入 DCS-120 扫描头。在扫描头内部，激光束由两个高速振镜 偏转。 扫描头的扫描透镜将激光束 投激光束 。在显微镜内部，光束通过二色性分光镜，并投射到显微镜物镜的后孔径上。显微镜物镜将光束聚焦到样品内部的成像平面上。随着光束被振镜 偏转振镜 激光焦点在样品的成像区域内进行光栅扫描。

 

为了获得最大的空间激光束 必须激光束 填满显微镜物镜的后孔径。鉴于扫描透镜和管透镜通常的焦距，这种情况并不会自动实现。因此，激光束在进入扫描器之前会被扩大1.5倍。激光束在后孔径处的直径约为12毫米，这足以填满即使是最大型显微镜物镜的孔径。孔径被过度填满并不构成问题。 由于激光器的输出功率远超实际需求，因此由此导致的激发功率损失是可以接受的。

来自样品的荧光光通过显微镜物镜被收集回来，并经由一条非扫描光路传输。L1和L2构成一个潜望镜。该潜望镜还能收集光子 未被显微镜物镜完全准直光子 ，例如光子 穿过厚样品光子 散射光子 。 荧光被分成两个波长区间，并由两个 bh HPM-100-40 混合探测器检测 [6, 7]。来自探测器的单光子脉冲被记录在两个 SPC-180N TCSPC / FLIM 模块中 [1]。 SPC-180N模块会确定激发光子 检测时间，以及光子被检测时扫描仪的位置。这些信息用于构建FLIM图像。这些图像由像素阵列组成，每个像素包含一个在大量时间通道中的完整荧光衰减曲线[1]。

激光束 的扫描激光束 飞回阶段的光束消隐均由bh GVD-140扫描控制器卡通过硬件控制。激光强度控制则通过Axon AOM控制信号输入实现。该信号同样由GVD-140卡提供。 整个系统由bh公司的SPCM数据采集与控制软件[1]运行，提供了一个集扫描控制、激光控制、数据采集和数据分析于一体的完全集成FLIM系统。图3展示了该FLIM系统的用户界面。

图3
图3：SPCM数据采集与控制软件主面板

 

结果

图4至图6展示了AXON 拍摄的FLIM图像。所有图像均使用40倍、数值孔径（NA）为1.3的油浸物镜拍摄。数据分析采用bh SPCImage NG FLIM数据分析套件完成。 图4和图5分别展示了平均（振幅加权）寿命和代谢指标a1的彩色编码FLIM图像。右上角显示了所选图像参数（tm或a1）的直方图，右下角显示了光标位置处的衰减曲线。最右侧显示了所选点位的衰减参数。

图4
图4：猪皮组织，NADH成像，双指数衰减的振幅加权平均寿命

 

图5
图5：猪皮组织，NADH成像，快速衰减组分的振幅a1。a1是代谢状态的指标。

 

图6显示了酵母细胞。 所选的发射滤光片用于检测440至470 nm波长范围，从而将光谱范围限定在NAD(P)H的检测范围内。470 nm的上限检测值看似非常严格。然而，将检测范围限制在470 nm以下是必要的，以避免检测到FAD和FMN的荧光。这些化合物虽与NAD(P)H同时被激发，但对代谢状态的依赖性不同。 数据采用SPCImage NG的MLE算法进行分析，从而在图像的各个像素中获得了高精度的双指数衰减参数。图中显示 ，显示 快速衰减分量的振幅。它代表未结合的NAD(P)H的量。由于结合/未结合的比率随代谢状态而变化，a1也被称为“代谢指标”[1]。

 

如图所示，不同细胞中的a1值存在显著差异。这表明不同细胞的代谢状态各不相同。高a1值（蓝色区域）代表更倾向于糖酵解代谢，而低a1值（黄色区域）则显示更偏向氧化代谢。

图6
图6：酵母细胞，NADH图像，振幅a1，快速衰减分量，代谢状态指标
 
“我们已经高意 ）Axon ，结合bh公司的精密扫描仪、光学元件、探测器、TCSPC/FLIM电子系统以及数据分析软件，能够提供关于活细胞和组织代谢的精确信息。” 凭借其基于AOM的内部强度控制功能，该激光器可与bh公司的SPCM FLIM采集软件无缝集成。在光束阻挡和扫描器飞回阶段实现的光束屏蔽，以及可重复的强度控制，可有效保护样品免受局部光损伤。 总而言之，DCS-120 MP 与Axon 的组合是一款易于使用、高分辨率、激光扫描 度的激光扫描 显微镜。 

 

参考文献

  1. W. Becker，《bh TCSPC手册》第10版。Becker & Hickl GmbH（2023年），可于www.becker-hickl.com获取，印刷版可向bh索取。
  2. W. Becker, C. Junghans, H. Netz, 基于飞秒光纤激光器的双光子荧光寿命成像技术。应用说明，详见 www.becker-hickl.com
  3. W. Becker, C. Junghans, A. Bergmann, 《双光子荧光寿命成像揭示蘑菇孢子的超快衰减成分》. 应用说明 (2021), 可在 www.becker-hickl.com 获取
  4. W. Becker, A. Bergmann, C. Junghans, 天然类胡萝卜素中的超快荧光衰减. 应用说明, www.becker-hickl.com (2022)
  5. W. Becker, C. Junghans, V. Shcheslavskiy, 高分辨率多光子荧光寿命成像揭示人类毛发中的超快荧光衰减。应用说明，www.becker-hickl.com (2023)
  6. W. Becker, B. Su, K. Weisshart, O. Holub, 激光扫描显微镜中的荧光寿命成像与荧光相关光谱检测：砷化镓磷化物混合探测器提升检测效率. 《显微研究技术》74卷, 804-811页 (2011)
  7. 贝克尔与希克尔有限公司，混合探测器与MCP-PMT实现低于20皮秒的IRF宽度。应用说明，详见www.becker-hickl.com
“我们已经证明，高意 Axon 秒光纤激光器，结合bh公司的精密扫描器、光学元件、探测器、TCSPC/FLIM电子系统以及数据分析软件，能够提供关于活细胞和组织代谢的精确信息。”

– 沃尔夫冈·贝克尔，贝克尔与希克尔有限公司总经理，德国柏林

 


 



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