白皮书
双光子显微镜解决方案 激光调制解决方案
Overview<
自1990年发表关于双激光扫描 显微镜的开创性研究（Denk 等，1990）以来，该技术得益于激光技术飞跃性进步。这些进步推动了该技术从最初的物理实验室向细胞生物学、疾病研究以及先进神经科学成像领域的广泛应用。
大约在2001年，一款一体化可调谐钛Sapphire 激光器 这一趋势。 数年后，激光器 增加了自动色散控制激光器 优化显微镜样品平面处的脉冲持续时间。随着波长长于钛Sapphire 激光器上限的激发探针日益成熟且高效，2010年后，激光器制造商开始转向光学参量振荡器 满足扩展颜色范围、实现更深成像以及减少光损伤的需求。
在本文中，我们将探讨这一演进的下一阶段：将高速功率调制技术集成到激光系统，以及这如何实现更快的系统调试时间、最高性能和较低的拥有成本。
“在激光系统 中集成快速功率调制技术激光系统 更快的建立时间、最高性能以及较低的拥有成本。”
双光子显微镜中激光功率控制的要求
最简单的实现方式是，通过添加一个延相波片和一个偏振分析器来实现激光功率的连续调节。通过旋转波片，通常可以将激光功率通过分析器的透射率从0.2%调节至约99%。若将波片电机化，即可实现该过程的自动化，从而调节显微镜成像平面上的功率，例如以平衡不同深度帧上的聚焦通量。
然而，大多数现代激光扫描 显微镜都需要更快的调制速度。例如，在仅需单向采集数据的光栅激光扫描 ，激光必须在“回扫操作”期间被屏蔽，以避免不必要的荧光激发或光漂白。对于谐振式振镜扫描仪，其上升/下降时间可短至几微秒。 在此领域，必须考虑光学调制方法。
电光调制
电光调制器（EOM）利用波克尔斯效应，通过使光束产生相位延迟来调制激光功率。该效应是指在非中心对称晶体中施加电场时，会诱导出双折射现象。与之前一样，调制器系统中还使用了偏振分析器。
Pockels单元 配置为纵向激励几何结构，以适应使用相对晶体较大光束。在这种情况下，典型的半波电压（即使偏振发生90度旋转所需的电压）约为6千伏，这在2P显微镜所需的速度和占空比下难以实现。 因此，大多数成像配置采用横向电场几何结构，使用更长的晶体从而显著降低了半波电压。晶体 通常晶体 2个或更多个串联配置，彼此之间相互旋转，以进一步降低所需的开关电压并补偿热负载效应。
必须注意通过晶体对准和偏置电压调整来优化脉冲对比度（即最小与最大传输功率之比），以获得最佳的图像对比度。
图1：横向波克尔斯细胞工作原理的简化示意图。通过调节施加的电场，可以调制分析器的透射率。
Pockels单元 在双光子显微镜领域Pockels单元 广泛应用Pockels单元 尤其受到“自制设备爱好者”群体的青睐，因为其部署相对简单，特别适合仅需在常见双光子波长下使用中等功率的用户。
例如，基于二氘磷酸钾（KD*P）的滤光片在波长约1100 nm以内的2P应用中，具有出色的透射率、速度和对比度特性，且适用于中等功率的激光器。 此外，KD*P 具有较低的群速度色散特性，从而使群延迟色散 (GDD) 降至最低。因此，在使用激光器 色散预补偿且调谐范围有限的ultrafast 激光器 （如Sapphire 激光器）时，KD*PPockels单元 广受欢迎的选择。
图2： 双光子显微镜上典型的 波克尔斯细胞配置。电光调制器（EOM）位于用户右手正下方。照片由英国牛津大学帕克实验室提供。
声光调制
声光调制器（AOM）由一块透明晶体或玻璃构成，其上安装有压电换能器。当射频（RF）波施加到换能器上时，会诱导出声波，使晶体产生应变，从而形成折射率 。穿过该结构的光随后会发生衍射。
可实现的上升/下降时间与声波穿过激光束所需的时间成正比，因此可通过缩小晶体中光束的宽度来优化该时间。
衍射 分辨率以及由此确定的对比度，既取决于零衍射 与一次衍射 之间的分离角（θS），也取决于到目标工作平面的距离。
"The advent of one-box widely tunable lasers, in the order of 680-1300 nm and with powers in excess of 2 W, requires a new regime of performance and integration effort for laser modulation."
在双光子显微镜中，最常用的AOM材料是二氧化碲（TeO₂）。该材料在宽波长范围内具有出色的衍射 和高功率处理能力。仅需约30 dBm的适度射频功率即可达到最大透射效率。
二氧化钛（TeO2）声光调制器通常配置在布拉格相互作用区域，该区域可提供最佳的一衍射 ，而高阶衍射则被破坏性抵消。 需要注意的是，若要在最低射频功率水平下实现高效率，晶体长度需大于1厘米，这会导致不可忽视的群延迟色散（GDD）。考虑到其他下游光学元件 尤其是物镜光学元件 的色散效应光学元件 基于AOM的显微镜系统若能与激光器 色散预补偿激光器 配合使用，将能更好地在样品平面上维持最短的脉冲。
激光器 部署激光器 精心设计光学系统和控制电子电路。由于分离角（θS）既取决于射频驱动频率（即光栅周期），也取决于激光波长，因此必须对射频驱动频率进行精确校准，以确保在调谐激光波长时指向变化最小。此外，不同波长下达到衍射 所需的射频功率各不相同。 尽管AOM具有卓越的性能特征，但在可调成像系统中，由于需要精确控制射频频率和功率，并管理相对较大的梯度波前（GVD），导致集成难度较大，这迄今为止限制了AOM在许多自建系统和定制应用中的使用。
宽调谐范围激光器器中的调制
随着波长范围在680至1300纳米左右、功率超过2瓦的单箱宽带可激光器问世，激光调制技术在性能和集成方面需要达到一个新的水平。
通常使用的KDPockels单元 在高功率下Pockels单元 热泛光效应，这对光束指向、光束腰完整性及使用寿命均有不利影响。 更长的波长还带来了更高的驱动电压和对比度方面的挑战。钽酸锂是一种适用于更宽调谐范围的可行电光调制器材料，但商用产品的群延迟色散高于激光器可补偿范围，从而导致脉冲变长且峰值功率降低，不利于高效成像。
如前所述，尽管基于AOM的解决方案 在成本和性能方面具有潜在优势，但其部署解决方案 高度的光学设计和电子控制专业知识，而许多生物成像机构往往难以具备这些条件。不过，一些显微镜供应商解决方案 AOM解决方案 作为集成方案解决方案 市场。
2017年，高意 ，将AOM调制与激光源集成的交钥匙解决方案将使用户和显微镜行业均受益。解决方案 工业 ultrafast 激光器集成解决方案 积累的专业经验高意 “全功率控制”（TPC）——Chameleon 激光器的全集成选项。
Total Power Control, available on Chameleon Discovery NX, provides high contrast (>1000:1) and high speed (<1 μs rise time) modulation across a full octave tuning range of 660 nm to 1320 nm in a hands-free automated package.
图 3： Chameleon NX 的 TPC 及调制后的典型最大输出功率。
射频频率和功率校准及调整的所有参数均已预先编程到激光器内部，因此用户或显微镜集成商只需提供所需的设定波长和功率水平即可。
由于AOM（声光调制器）具有极高的性价比Chameleon NX TPC的1040 nm固定波长输出也配备了专用的AOM和驱动器。
可通过串行/USB命令或快速模拟控制输入方便地控制电源。
图 4：可通过随附的图形用户界面直接更改输出功率
或者用户可提供额外的快速模拟输入，用于反激式消隐
以及快速抖动控制。
未来趋势
随着双光子成像技术在OEM和临床前应用领域的应用范围不断扩大，市场对单波长、高性价比飞秒光源的需求日益增长。Axon 紧凑型ultrafast 完美满足了这些需求。
从产品概念阶段开始，TPC功能就被整合到Axon ，以便简化其在新型显微镜设计和应用中的部署。这为那些将双光子显微镜系统作为可移动诊断、临床或高通量筛选设备的一部分（而非纯粹的科研 ）的应用，带来了极致的集成便利。
在尖端科研，高功率激光器 在基于光遗传学刺激的全光在体成像技术中激光器 关键作用（Yuste, 2012）。 数十瓦的激光功率通过空间光调制器（SLM）被分割成多个独立光束，从而能够分别作用于数十或数百个神经元。这种光学控制方法需要短且可定制的脉冲序列。激光器 高意 Monaco 等高功率光纤激光器，凭借全光纤设计架构，能够满足这些应用所需的灵活性。由此产生的高平均功率、高能量激光要求，以及在亚毫秒时间尺度上切换刺激光束的需求，对现有的波克尔斯细胞技术构成了特殊挑战。为此，AOM技术已全面集成到Monaco，以实现精确的脉冲控制、简化的显微镜设计以及提高成像系统的可靠性。
图5： Discovery TPC实现的高对比度、高帧率钙成像示例 。（小鼠体内实验：表达RCaMP1.07并在1100 nm波长下被激发的神经元（红色）与表达GCaMP6s并在940 nm波长下被激发的星形胶质细胞（绿色）的叠加图像。激发光源Chameleon TPC。图片来源：苏黎世大学Weber实验室。）
图 6：所有Axon 激光器 TPC 功能作为选配，且采用统一的外形规格。
图7： Chameleon NX TPCAxon TPC组合使用。TPC技术简化了光学布局，并节省了宝贵的太空。图片由多伦多病童医院的Neil Merovitch提供。
摘要
在本技术说明中，我们探讨了激光器 双光子显微镜激光器 调制激光输出 的两种主要方法——电光调制和声光调制。迄今为止，大多数“自制设备者”都选择了电光调制器（EOM），因为这种高电压供电的设备在光路中部署相对简单。 多家显微镜厂商在其激光传输系统中部分集成了电光调制器（EOM）或声光调制器（AOM），并通过软件架构同时控制显微镜和激光器。凭借在激光器 全天候生产环境激光器 的高功率光激光器 方面的制造经验高意 声光调制器（AOM）在体积、成本、速度和整体性能方面的优势同样适用于双光子成像应用。 通过将 AOM 的精密控制集成到Discovery NX 的激光软硬件架构中， AxonMonaco软件及硬件架构中，将AOM的精密控制功能进行集成，使得双光子用户——无论是自建系统者还是显微镜厂商——都能受益于大幅简化的光学配置，且更易于操控，应用范围涵盖从先进神经科学到医学诊断的各个领域。